Monoklonal Antikor Saflaştırma Metotları -I

PROTEİN

Değerli Meslektaşlarım, Dostlarım

Bildiğiniz gibi bir süredir bu mecra vasıtası ile sizler ile bir araya geliyor ve sektörümüzü yakından ilgilendirdiğini düşündüğüm konularda yazılar yayımlıyorum. Daha önce LinkedIn  üzerinden Biyoteknolojik İlaçlar (Biyofarmasötikler) hakkında çeşitli bilgiler aktarmaya başlayacağımın müjdesini sizler ile paylaşmıştım.

Biyofarmasötikler ile ilgili belirlemiş olduğum ana konu başlıklarından olan Monoklonal Antikorların Saflaştırma Metotları içinde en önemlilerinden birisi kabul edilen “Kromatografi”‘de Afinite Kromatografisi üzerinde durmaya çalışacağım.

Yayımladığım yazılarımın bir kısmı İrlanda’da Biyofarmasötik Bilimler konusunda öğrenim gördüğüm konuları da kapsayacaktır.

Şimdi dilerseniz konular üzerinden geçmeye başlayalım;

Biyofarmasötik Ürün üretiminde altakış işlemlerinde çeşitli saflaştırma metotları kullanılmaktadır. Kromatografi Saflaştırma Adımlarından sadece birisidir. Kromatografi kendi içinde fonksiyonlarına göre çeşitli modlara ayrılabilir.

Bunlar arasında Afinite Kromatografisi, İyon Değişim Kromatografisi, Jel Filtrasyon Kromatografisi, Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi ve Ters Faz Kromatografisi sayılabilir.

Şekil 1 Afinite Kromatografisi

Şekil 1 AK

  • Afinite Kromatografisi, bir proteinin, spesifik kromatografi matrisine bağlanmış fonksiyonel gruplara veya ligantlara bağlanması için belirli biyolojik fonksiyonlardan yararlanır. (Şekil 1)
  • İyon Değişim Kromatografisi ile ayırma, hedef molekülün yüzey yüklerindeki ve kromatografi matrisindeki farklılıklara dayanır.

İki tip iyon değişim kromatografisi vardır;

  • Katyon Değiştirme Kromatografisi, pozitif yüklü molekülleri bağlamak için negatif yüklü bir matris kullanır, anyon değişim kromatografisi, negatif yüklü molekülleri çekmek için pozitif yüklü bir matris kullanır. (Şekil 2)

Şekil 2 İyon Değişim Kromatografisi

Şekil2İD

  • Jel Filtrasyon Kromatografisi molekülleri büyüklüklerine göre ayırır. (Şekil 3)

Şekil 3 Jel Filtrasyon Kromatografisi

Şkeli3JF

  • Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi reçineleri, hedef molekülün hidrofobik kısımlarını çeken ve bağlayan, oktil, butil veya matrise eklenen fenil grupları gibi hidrofobik gruplara sahiptir. (Şekil 4)

Şekil 4 Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi

Şekil 4HE

  • Ters Faz Kromatografisi kromatografi matrisine bağlanan hedef molekülü serbest bırakmak için organik çözücülerin kullanıldığı bir tür hidrofobik etkileşim kromatografisidir.

Kolon kromatografik süreçlerin validasyonu

Reçine yaşam boyu çalışmaları, kalıntı ve safsızlık spike çalışmaları, sanitizasyon ve saklama çalışmaları ve her bir bireysel sürece özgü diğer çalışmaları içerir.

Protein saflaştırması, herhangi bir biyoteknolojik ilaç prosesinin önemli bir parçasıdır, çünkü bu, safsızlıkların giderilmesi ve insan kullanımına uygun nihai bir ürünün üretilmesi için birincil araçtır.

Her kromatografi tipi, yük, boyut veya hidrofobiklik gibi belirli özelliklerde farklılıklara göre ayrılır; Bu nedenle, belirli bir tip belirli faydalar sunarken, diğeri uygun olmayabilir. Kromatografi yönteminin seçimi büyük ölçüde hedef molekülün özelliklerine ve nihai ürünün istenilen saflık seviyesine bağlıdır. Tek bir kromatografi basamağının, belirgin saflık artışları ile sonuçlanmasına rağmen, genellikle arzu edilen saflaştırma seviyesini sağlamak için birkaç kromatografi yönteminin bir kombinasyonu gereklidir.

Geçmişte, pH, iyonik güç, sıcaklık, tuz, çözücü veya polimerler ile çökeltme, biyoteknolojik ürün ayrışmasının ana yöntemleri olmuştur.

Afinite Kromatografisi, protein ve monoklonal antikor moleküllerini biyolojik aktivitelerine göre kimyasal veya fiziksel özelliklerine göre ayırma yeteneğine dayanır. (Şekil 5)

Şekil 5 Afinite Kromatografisi

Şekil 5

Diğer kromatografik yöntemlerde olduğu gibi, Afinite Kromatografisi birçok farklı uygulama alanına sahiptir.

Kromatografi türlerinin hemen hemen hepsi, monoklonal antikorların, çeşitli enzimlerin, karbonhidratların, özellikle proteinlerin yanı sıra antijen ve antikor saflaştırma işlemlerinde kullanılır.

Afinite Kromatografisi diğer yöntemlere göre birçok avantajı vardır. Özellikle hızlı sonuçlar, kullanımı kolay, tek aşamada yüksek saflık eldesi (% 85-95 saflıkta) çözünürlük, kapasite vb. birçok faktör bu yöntemi diğerlerine göre daha önemli bir konuma getirmiştir.

Afinite kromatografısindeki en dikkat çekici noktalardan biri, uygun koşullar sağlandığında tek bir aşamada yüksek oranlarda protein veya monoklonal antikorun saflaştırılabilmesidir. Tüm yöntemlerde olduğu gibi, Afinite Kromatografisi de avantajların yanı sıra bazı dezavantajlara sahiptir.

Alt akış proseslerinde saflaştırma çok önemlidir. Saflaştırılacak olan molekül bir monoklonal antikor ise, safsızlıklar, konak hücre proteinleri, virüsler ve virüs benzeri parçacıklar, DNA ve diğer kirletici maddeler bu aşamada mümkün olduğunca uzaklaştırılmalıdır.

Afinite Kromatografisi ve Protein A kromatografisi, hasattan ve temizlikten sonraki ilk seçenek olarak ve Monoklonal antikorların saflaştırılması için alt akış işleminde seçilir.

Alt Akış İşlemlerde Aşamalar

Aşağıdaki şekilden kolaylıkla görülebileceği gibi (Şekil 6), adım sayısı arttıkça, saflık orantısal olarak artar. İlk adım dikkate alındığında, saflığın oldukça düşük olduğu görülür, ancak son adım, polisajda en yüksek saflık seviyesine ulaşılır.

Şekil 6 Saflaştırma /Adım

SEKIL6

Proses boyunca korumamız gereken ürün özelliklerinden biri ürün stabilitesidir. Aynı zamanda, sayısız zorluklarla uğraşırken, ürün kalitesi, saflık ve bütünlüğün korunmasına azami dikkat göstermeliyiz.

Karşılaşılan başlıca zorluklardan bazıları

Üreticinin hücre kültürü ortamında karşılaştığı en kritik konular amino asitler, inorganik tuzlar, vitaminler, d-glukoz ve diğer organik maddelerdir.

Beslenme ortamında, sığır serumu ve proteinleri de üstesinden gelinmesi gereken zorluklar arasındadır. Bununla birlikte, hücre söz konusu olduğunda, üretici birçok zorluğun üstesinden gelmelidir. Hücresel kalıntılar, konak hücre proteinleri, virüsler, nükleik asitler ve lipidler göz önünde bulundurulması gereken en önemli faktörler arasındadır. Ek olarak, Endotoksin, Mikoplazma vb. kirletici maddelerin uzaklaştırılması gerekir.

Aşağıdaki 4 parametre birbiriyle sürekli etkileşim halindedir. (Şekil 7) Örneğin, bir yakalama adımı ele alındığında, yüksek hacimli işlemler için yüksek kapasite ve hız gereklidir.

1-Çözünürlük

2-Kapasite

3-Geri Kazanım

4-Hız

Şekil 7  4 Parametreli Piramid

Şekil7 PR

Alt akış işleminin her bir ardışık adımı, kontaminasyon riskinden kaçınmak ve malzeme kaybının en düşük seviyede tutulmasını sağlamak için çok hızlı bir şekilde ele alınmıştır.

Yüksek çözünürlük, yüksek geri kazanım, yüksek hız ve yüksek kapasite elde edilmesinin bir sonucu olarak, alt akış süreci oldukça başarılıdır. Kromatografide, özellikle her bir parametre açısından alt akış işleminde belirgin bir avantaj vardır. Tablo 1’e bakınız.

Tablo 1 Metot Özellikleri

Tablo 1

Tablo 1’de kolayca görülebileceği gibi, ayırma prensibinde metot seçimi, çözünürlük, hız ve kapasite çok önemli parametrelerdir. Seçtiğimiz afinite kromatografisi ele alınacaksa, özellikle mükemmel çözünürlük, çok yüksek hız ve yüksek kapasite nedeniyle bu kromatografi yönteminin, monoklonal antikorların saflaştırılmasında birinci adım olarak ele alınması mümkündür.

En uygun yöntem nasıl seçilir?

Rekombinant proteinin, örneğin IgGl ve kirletici maddelerin özelliklerine dayanarak hangi kromatografik yöntemin seçileceğine karar verilmelidir. (Tablo 2-3)

Tablo 2  Protein Özelliklerine göre seçilecek kromatografi tekniği

Tablo 2

Tablo 3 Kromatografi tekniklerinin yakalama, saflaştırma ve polisaj aşamalarında karşılaştırılması

Tablo 3

Afinite Kromatografisi

Biyomoleküllerin pH ile çökeltilmesi, iyonik güç, sıcaklık, tuz, çözücü veya polimerler ile ayrılmasına dayanan geleneksel yöntemler, yerini biyolojik temelli ayırma yöntemleri ile değiştirmiştir. Moleküler tanıma dayalı Afinite Kromatografisi, proteinlerin fiziksel veya kimyasal özellikleri yerine biyolojik işlevlerine göre ayrılmasına izin veren bir yöntemdir. Afinite Kromatografisi, biyo-afinite, immün afinite, DNA afinitesi, lektin afinitesi, boronat afinitesi, biyomimetik afinite ve metal iyonu afinitesi gibi çeşitli alt dallara ayrılır. Bu yöntemler proteinler, enzimler, karbonhidratlar, vitaminler gibi birçok molekülü ayırmak ve antijenleri ve antikorları saflaştırmak için kullanılabilir.

Afinite Kromatografisi, yüksek seçiciliği, hızı ve kullanım kolaylığı açısından diğer yöntemlere göre bazı avantajlara sahiptir. (Bkz. Tablo 3)

Bu yöntemin en büyük avantajı, hedef proteinin ideal koşullar altında tek bir aşamada saflaştırılabilmesidir. Bununla birlikte, yöntemde kullanılan malzemeler pahalı olduğu için, bunların büyük ölçekli saflaştırma işlemlerinde kullanımı sınırlıdır.

Afinite kromatografisi, hedef biyomolekülün, çözünmez bir destek malzemesi (matris) üzerinde hareketsizleştirilmiş ve hedef moleküle tamamlayıcı bağlanma uçları içeren ligantlar tarafından spesifik olarak ve tersinir olarak adsorbe edilmesine dayanan bir yöntemdir.

Ligant ve hedef molekül arasındaki biyolojik etkileşimler elektrostatik veya hidrofobik etkileşimler, van der Waals ve / veya hidrojen bağları ile elde edilebilir. Hedef molekülün ortamdan elüsyonu, ya bir rakip ligantın kullanılmasıyla ya da ortamın pH’ında, iyonik gücünde ya da polaritesindeki değişikliklerle (mobil faz) elde edilir.

Bileşiğin kolon ile ilgili elüsyonu sırasında kullanılan hareketli faz, bileşiği etkilememeli ve bileşiğin spesifik aktivitesinde veya fonksiyonunda herhangi bir değişikliğe neden olmamalıdır. Afinite Kromatografi matrisine bağlı bir ligantın bir afinite şeklinde seçilmesi, kolonda başarılı bir ayrımın elde edilmesinde en önemli faktörlerden biridir.

Ligantların çoğu biyolojik kökenli olmasına rağmen, biyolojik olmayan doğal veya sentetik moleküller de ayırma için kullanılır. Kökeni ne olursa olsun, bu moleküller, biri yüksek özgüllüğe sahip ve diğeri genel amaçlı olan iki gruba ayrılır.

Yüksek özgüllüğe sahip ligantlar (monospesifik), sadece belirli bir bileşiği ayırt etmek için bir veya daha fazla yakından ilişkili bileşiğe bağlanabilir; genel amaçlar için kullanılan (grup spesifik) ligantlar, yapısal olarak benzer moleküller oldukları gruptaki bileşikleri ayırt etmek için ilişkili bir sınıfın moleküllerine bağlanırlar.

Bileşiklerin kolondaki ayrılmasını etkileyen bir başka önemli faktör, seçilen kolon matrisidir. Afinite Kromatografisinde, iyi bir kolon matrisinin aşağıdaki özelliklere sahip olması arzu edilir:

(1) Hidrofilik

(2) Büyük gözenekli

(3) Katı

(4) İnert

(5) Ayırma işleminde kullanılan kimyasallara karşı stabilizasyon.

Bir destek malzemesi olarak düşük performanslı afinite kromatografisinde genellikle agaroz, dekstran veya selüloz gibi büyük boyutlara sahip rijit olmayan bir jel kullanılır; yüksek performanslı Afinite Kromatografisi, sistemdeki dayanıklı silika veya sentetik polimer ve / veya akış hızına dayanan küçük ve sert parçacıklardan oluşan destek malzemelerini kullanır.

Boncuk biçimindeki agaroz jeli, makromoleküllerin iyi mekanik direnç ve akış özelliklerine sahip pürüzsüz geçişine izin vermek için yüksek gözenekliliğe sahiptir ve daha da önemlisi bu maddeler, kimyasal işlemlerle kolayca türevlendirilebildikleri için en çok kullanılan hareketsiz matrislerdir.

Afinite Kromatografisinde, katı ligantların uygun ligantları (immobilizasyon) bağlaması veya yakalaması önemlidir, böylece kolondaki ayrılma iyi bir şekilde yapılabilir.

Ligantların immobilizasyonu için yaygın uygulamalar; Spesifik olmayan ve biyospesifik adsorpsiyon, kovalent bağlanma yöntemleri,  moleküler supresyon yöntemleri gibi kovalent olmayan tekniklerdir. Uygun immobilizasyon tekniğinin seçimi önemlidir çünkü ligantın aktivitesini belirler. Genel olarak, immobilizasyon yöntemi en az iki adımdan oluşur. Birinci aşama, destek malzemesinin, ligantın kimyasal olarak bağlanabileceği bir forma dönüştürüldüğü aktivasyon fazıdır. İkinci aşama, uygun ligantın aktifleştirilmiş destek malzemesi üzerinde tutulduğu bağlanma aşamasıdır. Ligantın hareketsizleştirilmesini kolaylaştırmak için uygun fonksiyonel gruplar kullanılır. Bağlantı sağlayan temel fonksiyonel gruplar; birincil (birincil) aminler, sülfhidriller, aldehitler, karboksilik asitler ve hidroksillerdir.

İstenen bileşiğin ayrılacağı numune, ligantın afinite kolonundan bileşiğe bağlanmasına izin vermek için doğru pH, iyonik güç ve bileşim ile uygulama tamponu adı verilen mobil faz boyunca geçirilir. Bu koşullar altında, afinite ligantlarını, numune içinden geçerken uygun bağlanma uçlarından tamamlayan bileşikler, bu ligantlara bağlanır.

Diğer bağlanmamış bileşikler de yıkama yoluyla kolondan çıkarılır. Bağlanmamış bileşiklerin kolondan çıkarılmasından sonra, kolonda tutulan bileşiklerin elüsyonu, ayrılmayı destekleyen elüsyon tamponu olarak anılan hareketli fazın geçirilmesiyle gerçekleştirilir. Elüsyon tamponu ayrıca uygun pH, iyon gücü ve bileşime sahip olmalıdır.

Hareketli fazın pH değerindeki herhangi bir değişiklik, hedef molekülün veya ligantın konformasyonunda bir değişikliğe yol açabilir. Bu nedenle, bu değişiklikler yapıldığında hedef molekülün, ligantın veya destek malzemesinin yapısında geri dönüşümsüz denatürasyon olmadığından emin olmak için dikkatli olunmalıdır.

Diğer taraftan, hareketli fazın iyonik gücü ve tuz konsantrasyonundaki artış, iyonik etkileşimleri bozarak, hidrofobik etkileşimlerin oluşumunu teşvik edebilir.

Daha önce tarif etmeye çalıştığım gibi, Afinite Kromatografisi, piramitde yer alan dört faktörü rahatlıkla karşılayabilir. Yüksek seçiciliği, yüksek çözünürlük seviyelerine ulaşma kabiliyeti, yüksek kapasite verebilme yeteneği nedeniyle, özellikle monoklonal antikorların saflaştırılması sürecinde bir numaralı kromatografik adım olarak kabul edilir.

Çok yüksek seviyede saflık sadece tek bir adımda sağlanabilir. Bu yöntem, biyomoleküllerin biyolojik fonksiyonlarına göre saflaştırma sağlayan çok önemli bir seçenek olmaya devam etmektedir.

Afinite Kromatografisi, anahtar kilit mekanizmasına benzer bir fonksiyona sahiptir. Bir benzetme yapılacaksa, sahip olduğumuz anahtar ile başkalarının kapılarını açamayız çünkü her anahtarın kendi kilidi vardır.

Afinite Kromatografisinin aynı mantıkla çalıştığı söylenebilir. (Şekil 8)

Şekil 8 Anahtar- Kilit Mekanizması

Şekil6KL

Affinite Kromatografisinin diğer yöntemlere göre avantajları nelerdir?

  • Afinite kromatografisinde yüksek özgüllük ve seçicilik elde edilebilir
  • Saflık seviyeleri muazzam oranlara ulaşabilir. Bu yöntemin en önemli avantajlarından biri, yüksek saflık eldesinin bir adımda başarılabilmesidir.

Afinite Kromatografisinin diğer yöntemlere göre dezavantajları nelerdir?

  • Monoklonal antikor saflaştırmasında kullanılan sabit fazlar oldukça pahalıdır ve aşağı akış maliyetlerinin yaklaşık % 30-40’ını oluşturur. Protein A ve G ligantları oldukça pahalıdır ve stabilite zaman zaman zayıf olabilir.
  • Ligantın bağlanma teknikleri karmaşıktır ve serbest ligant, akışın akış aşağısında daha ileri saflaştırma komplikasyonlarına yol açar.
  • Protein A gibi kompleks ligantlar da zamanla sızma riski taşırlar.

Afinite Kromatografisi ile hangi safsızlıklar giderilebilir?

Hem üniversite, hem araştırma laboratuvarı hem de biyofarmasötik üreticileri, yıllardır ilgi duydukları proteinleri izole etmek ve Monoklonal antikorları saflaştırmak için Afinite Kromatografisi kullanmaktadır. Afinite Kromatografisi uygulama alanlarında yüksek başarı ile vazgeçilmez bir kromatografidir. Afinite Kromatografisini bu kadar önemli kılan faktörlerden biri, yukarıda bahsettiğim gibi iki reçine, Protein A ve G’dir.

Afinite Kromatografisinin Aşamaları

Afinite Kromatografisinde 6 temel aşama vardır

1-Numune hazırlama

2- Dengeleme

3- Numune bağlanması – bağlanmamış materyalin elüsyonu

4- Yıkama

5- Elute bağlı proteinler

6- Yeniden dengeleme

Afinite kromatografisinde bazı kritik faktörler göz önünde bulundurulmalıdır.

– Dinamik bağlama kapasitesi

– Protein Ölçümleri

– Kolon kapasitesi

– Ligant ve Protein bağlama kapasitesi

– Kolon çözünürlüğü

– Kolon dolgu ve kalifikasyonu

– HETP

– Kolon verimliliği

IgG Molekülü ve Monoklonal Antikor

Monoklonal Antikorlar son yirmi otuz yıl içinde protein terapötikleri olarak çok önemli hale gelmiştir. İlaç endüstrisinde, özellikle biyofarmasötik endüstrisinde en hızlı büyümeyi sağlayan sektördür. FDA tarafından onaylanan Monoklonal Antikorların sayısı her geçen gün artmaktadır. 2014 yılına göre FDA onaylı monoklonal antikor sayısı 40’tır. (Şekil 9)

Şekil 9 Monoklonal Antikor

Şekil8MA

Monoklonal antikorlar ileride yüksek bağlanma yetenekleri ile çok çeşitli hedeflere bağlanabilecektir. Her ne kadar popülariteleri yüksek olsa da, farklı monoklonal antikorların birbirine benzerliği, biyoterapötik ürün üreticilerinin platform üretim proseslerini tasarlamalarına ve geliştirmelerine yol açmıştır. Platform geliştirme süreci genellikle Deney Tasarımı tarafından ampirik olarak optimize edilir.

Monoklonal Antikorlar, çok büyük moleküler ağırlıklara sahip protein molekülleridir. Moleküler ağırlıklar 150kDa’nın üzerindedir. Y-benzeri yapıda 3 benzer lob vardır. Antikor molekülleri dört peptid zincirinden, iki ağır zincirden ve iki hafif zincirden oluşur.

Ağır zincirlerin molekül ağırlığı yaklaşık 50 kDa iken hafif zincirlerin moleküler ağırlığı yaklaşık 25 kDa’dır. Her bir monoklonal antikor, iki özdeş ağır zincir ve iki özdeş hafif zincir içerir.

Ağır zincirler, çeşitli disülfid bağları ile birbirine bağlanır. Bu bölgeye mafsal adı verilmektedir. Mafsal bölgesi ayrıca iki antijen bağlanma sahasının iki farklı antijene esnek bir şekilde bağlanmasına izin verir. Her ağır zincir, bir tek disülfid bağı ile bir hafif zincire bağlanır. Antikorlar sayısız sabit ve değişken bölge içerir.

Beş ana antikor türü vardır. Bu antikorlar sırasıyla IgG, IgM, IgA, IgD, IgE’dir. Farklı sınıflar, sabit ağır zincir bölgelerindeki farklılık nedeniyle birbirinden ayırt edilebilir. En yaygın olarak kullanılan Monoklonal antikorlardan şüphesiz IgG’dir.

IgG sınıfı dört alt sınıfa sahiptir. Alt grupların isimleri IgGl, IgG2, IgG3, IgG4‘tür.

IgG2 ayrıca küçük bir yüzdeyle kullanılırken, IgG1 piyasada bulunan birçok monoklonal antikoru oluşturur. Alt sınıflar arasındaki en önemli fark, mafsal bölgesidir. IgG1 antikorları, 15 kalıntı ve iki ağır zincir arasında disülfid bağları içeren mafsal bölgelerine sahiptir. Bu esneklik, iki Fab bölgesinin kendi ekseni üzerinde dönmesine izin verir. IgG2 antikorlarında, bu sayı 12 kalıntı ve dört disülfür bağı ile sınırlıdır.

Bugün üretilen monoklonal antikorların birçoğu benzer olduğundan ve protein A reçinelerinin prevalansı nedeniyle, üreticiler alt ve üst akış olarak iki kısımlı bir platform üretim prosesi geliştirmişlerdir. Platformun üretimini gösteren şema aşağıdadır.

Akış yönündeki akış, ilk hasat ve saflaştırma aşamalarını içerirken, yukarı akışlı sistem memeli hücre kültürünü içerir.

Protein A

Günümüzde Protein A kromatografisi ile hemen hemen tüm IgG terapötik ürünlerin saflaştırılması en basit yöntem olarak seçilmiştir. Bu başarının arkasında, son derece basit mekanizması yatıyor. Kontaminasyona yol açan maddeler bağlanmazken IgG çok iyi bağlanır. Basit adımlar saf IgG’nin yüklenmesi, yıkanması ve elüe edilmesini içerir.

Ancak, her şey bu kadar basit değildir çünkü Protein saf IgG’yi elüe etmez çünkü hem konak hücre proteinleri hem de diğer kontaminasyona yol açanlardan bulaşma içerir.

IgG saflaştırmasında birincil hedef, IgG fragmanlarının ve alt sınıfların Protein A’ya yüksek derecede ilgi göstermesidir.

Protein A, Poliklonal ve Monoklonal antikorlar gibi IgG tipi antikorların Fc bölgesine oldukça duyarlıdır. Protein A, Staphylococcus aureus’tan izole edilen bir tür hücre duvarı proteindir.

Protein A İçeren Alt Akış Prosesi Akış Diagramı

Şekil10

Bazı sakıncaları ve faydaları

İlk geri kazanım ve arıtma, alt akış arındırma işleminin ilk adımıdır. Protein A kromatografisi, monoklonal antikor platformu saflaştırma işleminin ana bileşenidir.

Yüksek bağlama kapasitesi, özgüllük, seçicilik ayrıca monoklonal antikorların üretimini de kolaylaştırır. Protein A ligantının farklı IgG moleküllerinin Fc bölgesine bağlandığı gösterilmiştir. Protein A’nın, safsızlıkları gidererek yüksek bir akış oranı ile safsızlıkları uzaklaştırmak için kullanılabileceği de bilinmektedir. pH 6.0-8.0 arasında 20 mS / cm (birçok durumda 25-50 mg / mL) iletkenliğe sahiptir. Bununla birlikte, bu avantajların yanı sıra bir takım dezavantajlar vardır. Başlıca dezavantajlardan biri, özellikle de bu yüzden çok pahalı ve sınırlı bir ömrü olmasıdır.

En çok kullanılan reçinelerden bir örnek bağlanma kapasitesi 2.4 dakikada yaklaşık 35 mg / mL’dir. Hücre kültürü süpernatantı, netleştirildikten sonra doğrudan Protein A reçinesine yüklenebilir. Hemen hemen tüm konak hücre DNA’sı Protein A prosesi ile giderilir. (yaklaşık yüzde 99.9). Konak hücreli proteinlerin birçok durumda 100-500 ppm seviyesine düştüğü bildirilmiştir. Viral arınma 2.5-5log10 azalma değeri sık görülen bir durumdur.

Son olarak, ürün verimleri incelendiğinde % 95-100 değerine ulaşıldığı bildirilmiştir.

Ana dezavantajlardan biri düşük pH elüsyonudur. Monoklonal antikorlar elüsyon pH fazında beklendiği kadar stabil değildir ve bu aşamada agregasyon (kümelenme-topaklanma) görülür. Monoklonal agregasyon pH 4.0 seviyelerinde bildirilmiştir. Düşük pH’ın neden olduğu agregasyonlar diğer adımlarla giderilmelidir.

Sonuç olarak, bahsedilen dezavantajlar olmasına rağmen, aynı kalite parametrelerine sahip olabilecek  Protein A dışında birşey yok gibidir.

2016 yılının başında hem FDA hem de Avrupa İlaç Ajansı tarafından onaylanan 47 monoklonal antikor vardır, bu arada geliştirilmekte olan ürünlerin sayısı 500’e yaklaşmaktadır.

Uzun süreli kullanım ve büyük hasta sayıları nedeniyle monoklonal antikor tedavisinin yüzlerce veya daha fazla kilogram yıllık üretim ile sonuçlanması beklenmektedir. Bu nedenle, maliyet etkin ancak verimli monoklonal antikor üretimi, sektör için en önemli sorun haline gelmiştir.

Hücre kültüründeki en son gelişmeler ve ilerlemeler ile büyüme ve üretimin besin kazanımları, beslenme stratejileri, optimizasyon ve proseslerin kontrolü, 12 günlük kesikli beslemeli parti proseslerinde  5-10 g / L’lik bir ekspresyon seviyesine ulaşmıştır.

Daha yüksek seviyelerin elde edilmeye başlanması ile birlikte, proses kısıtları ve darboğazları üst akış’dan alt akış yönünde kaymaya başladı, böylece üst akış ve alt akış maliyetleri  birbiri ile rekabet etmeye başladı. Protein A reçineleri bile tek başına alt akış işlemlerinde maliyetin yaklaşık dörtte birini oluşturur. Özellikle yüksek dinamik bağlama kapasitesine olan yoğun ilgiden ötürü, Protein A daha fazla talep edilebilir. Protein A reçinesinin optimal seviyesi maliyetleri düşürür ve aynı zamanda safsızlıkları önler.

Protein A reçinesinin diğer bir dezavantajı şüphesiz antikorla bereber sıklıkla ayrılmasıdır. Hasat edilen hücre kültürüyle yapılan kromatografik çalışmalarda, hem Protein A fragmanları hem de protein bulunabilir. Filtrelenmiş proteinin moleküler ağırlığı yaklaşık olarak 6-40 kDa’dır ve artabilir.

Protein Belirli bir noktaya EDTA eklenerek bir parçalanma devam ettirilebilir. Monoklonal antikor üretim prosesinde Protein A nın konak hücre proteinlerinin, DNA’nın, adventif virüslerin ve prosese bağlı kirleticilerin uzaklaştırılmasını içerir. Protein  A adımı ayrıca bir hacim azaltma adımı olarak görev yapar.

Yıkama aşamasının, kolonun yüklenmesi ve elüsyon arasında yer aldığına dikkat edilmelidir. Bu, Konak Hücre proteini ve diğer birkaç olası kirletici maddenin uzaklaştırılması için gerçekleştirilmelidir.

ICH Q5 kılavuzuna göre, memeli hücre kültürü kullanılarak üretilen ürünler, virüsleri ve ayrıca güvenlik amacıyla kromatografide sağlanan klirensi azaltmak için en az iki ortogonal adımın başarılmasını gerektirir.

Birçok monoklonal antikorun düşük pH’ta yüksek seviyede sabit kaldığı düşünüldüğünde, retro virüs modelleri dahil olmak üzere zarflı virüslerin inaktive edilebildiği antikor saflaştırma işleminde düşük bir pH inkübasyon adımı gerçekleştirilebilir.

Protein A ile gerçekleştirilen LRV’lerin uzaklaştırılması ve inaktivasyonu  ve düşük pH inkübasyonu ayrı ayrı değerlendirilir. Her birinin farklı mekanizmalarla çalıştığı ve virüs temizliğinde ortogonal adımlar olduğu için ayrı ayrı analiz edilmesi önemlidir. Polimeraz Zincir reaksiyonu testi, Protein A kromatografisi ile virüs uzaklaştırılmasını test etmek için kullanılabilir.

Protein A Afinite Kromatografisi yerine ne tür alternatifler uygulanabilir?

Protein A reçinelerinden son günlerde sızıntı yapmaya daha az eğilimli olanlar, daha iyi sonuçlar sağlayabilir. Bununla birlikte, Protein A sızmasının önemli miktarda giderilmesi gerektiğinde, iki aşamalı bir saflaştırma işlemi, ardından bir katyon değiştirme prosesi veya karışık mod kromatografisi tercih edilebilir.

Buraya kadar olan kısımda Kromatografi Çeşitleri, Afinite Kromatografisi ve Protein A hakkında bilgi aktarılmıştır. Gelecek yazımda Protein Saflaştırma Metotları üzerinde durulacaktır.

Hepinize Sağlıklı, Huzurlu Günler Dilerim

Sevgilerimle

Referanslar

  • Strategies for Protein Purification Handbook – Handbooks from GE Healthcare
  • Protein Purification, Principles, High Resolution, Methods and Applications Jan-Christer Janson
  • Protein Expression in Mammalian Cells Methods & Protocols Springer Series
  • Affinity Chromatography Vol. 1 Antibodies – handbooks from GE Healthcare
  • Affinity Chromatography Vol. 2 Tagged Proteins – handbooks from GE Healthcare
  • Affinity Chromatography Principles and Methods – handbooks from GE Healthcare
  • Protein Purification Handbook Amersham Biosciences
  • Antibody Purification Handbook Amersham Biosciences
  • Affinity Chromatography Sameh Magdeldin
  • Industrial Purification of Pharmaceutical Antibodies -Biotechnology and Genetic Engineering Taylor & Francis
  • Pharmaceutical and Biomedical Applications of Affinity Chromatography: Recent Trends and Developments
  • Biotechnology and Biopharmaceuticals -Rodney J. Y. Ho
  • Bioprocess Engineering Principles – Pauline M. Doran
  • Peptide and Protein Design for Biopharmaceutical Applications – Knud J. Jensen